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                膠內酶解質譜樣品前處理

                膠內酶解質譜樣品前處理
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                膠內酶解質譜樣品前處理-蛋白考染膠

                溶液配制:

                1、水:HPLC級;乙腈:HPLC級;乙醇:HPLC級;

                2、200mM NH4HCO3溶液:取NH4HCO3 790.6mg 加水溶解并稀釋到50ml。稀釋4倍得到50 mM

                NH4HCO3溶液,稀釋8倍得到25 mM NH4HCO3溶液;

                3、25mM NH4HCO3的50%的乙醇-水溶液(考染脫色液): 50%乙醇-水溶液和50mM NH4HCO3

                溶液等比例混勻;

                4、10%乙酸的50%乙醇-水溶液;

                5、DTT溶液:10mM DTT的25mM NH4HCO3溶液(1.54mg/ml,現配此濃度,-20℃保存須兩天內用完);

                6、IAA溶液: 55mM IAA的25mM NH4HCO3溶液(10.175 mg/ml,現配此濃度,避光保存,-20℃

                保存須兩天內用完);

                7、Trypsin 溶液:取儲存于-80℃的分裝濃縮酶溶液(濃度為100ng/ul(20ug到200ul),

                溶于50 mM NH4HCO3溶液中),用50 mM NH4HCO3溶液稀釋為10ng/ul,全程冰上操作;

                8、50%乙腈-水溶液(含5%三氟乙酸);

                9、75%乙腈-水溶液(含0.1%三氟乙酸);

                10、0.1%三氟乙酸-水溶液;

                11、50%乙腈-水溶液(含0.1%三氟乙酸)。

                12、避光新鮮配置脫色液(銀染):50 mM NaS2O3: 15 mM K3Fe(CN) = 1:1混合

                取膠

                1.用超純水清洗膠塊2次,用手術刀片切下膠上目標條帶,用手術刀片充分切碎(1mm3大小,

                用HPLC級異丙醇和水分別洗滌手術刀和鑷子)。

                第一天:

                考馬斯亮藍染色凝膠的脫色

                2.把切碎的膠塊置于1.5ml管中(預先加入1ml考染脫色液,含25mM NH4HCO3的50%的乙醇-

                水溶液),室溫震蕩15-20min(在混勻儀中高速震蕩混勻),重復2-3次,直至膠塊無色,14000rpm離心1min, 去上清。

                3.加入1ml 10%乙酸的50%乙醇-水溶液在恒溫混勻儀上室溫震蕩洗滌膠塊2次,每次30分鐘,

                去上清。

                4.加入1ml水,在恒溫混勻儀上室溫輕微震蕩洗滌膠塊膠塊2次,每次5-10分鐘,去上清。

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